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Applications - Presentations Autores: Paul Held, Departamento de Aplicações, BioTek Instruments, Winooski, VT Gavin Picket, Keck-UNM Genomics Resource, Universidade do Novo México, Albuquerque, NM Este cartaz foi mostrado no Simpósio Internacional sobre Automação e Robótica de Laboratório, de 14 a 17 de outubro de 2001 A produção de microarrays requer a detecção de um grande número de fragmentos de DNA únicos em vários substratos diferentes. Embora vários instrumentos comercialmente disponíveis automatizassem esta tarefa de manchas, a preparação da amostra, a propagação da cultura e a manutenção da biblioteca de DNA são muitas vezes realizadas manualmente com pipetas multicanal em formatos de 8 x 12, 96 poços ou 16 x 24, 384 poços. Pipetas multicanal manuais, enquanto são mais eficientes do que pipetas de canal único, ainda representam uma grande quantidade de pipetagem com muitas oportunidades para erros de pipetagem. Aqui descrevemos o uso do Sistema de pipetagem automatizado Precision 2000 TM para realizar muitas das tarefas necessárias de pipetagem necessárias para a preparação de amostras para manchas de microarrays. Estas etapas incluem: a propagação de bibliotecas de plasmídeos, preparação de reação de PCR, tratamento de produtos de PCR para eletroforese em gel de agarose e a reconstituição de amostras liofilizadas antes da mancha de microarrays. A Precision 2000 possui uma plataforma de seis estações completamente configurável para manter as dicas de pipeta, as calhas de reagente e as microplacas (96 e 384 poços) para a transferência de fluidos. A plataforma é removível, permitindo a facilidade de uso múltiplo, fácil limpeza e configuração do instrumento. O braço de pipeta de 8 canais move-se para cima e para baixo, bem como de lado a lado, enquanto a plataforma se move de frente para trás para fornecer acesso completo a todos os locais na plataforma de trabalho e configuração completa. O braço da pipeta usa uma tecnologia proprietária para capturar e selar de forma confiável qualquer dica padrão com barris individuais e flutuantes que compensam as dicas fora de posição. É também disponível um colector de 8 canais de distribuição rápida opcional, que utiliza uma bomba de seringa bidirecional precisa para distribuir fluidos de forma rápida e rápida a partir de um grande reservatório não pressurizado. O Precision 2000 possui um microprocessador interno que controla todos os movimentos. O software flexível, tanto a bordo como baseado em PC, oferece recursos de programação completos. Para uma automação mais completa, as interfaces de robótica podem ser desenvolvidas usando os comandos do software ActiveXreg. O tamanho pequeno Precision 2000rsquos, com uma pegada de 15 x 21 polegadas e uma altura de 16 polegadas, permite que ele seja usado quase em qualquer lugar, incluindo a maioria dos armários de segurança biológica ou exaustores químicos. BioTek Precision 2000 Sistema automatizado de pipetagem de microplacas MJ Research Thermocycler Qiagen BioRobot 3000 BioRobotics Microarray Spotter Savant Lyophilizer BioTek PowerWave X Microplaca Espectrofotômetro Materiais e Métodos Para determinar as capacidades de pipetagem de baixo volume Precision 2000, as soluções de corante concentradas foram dispensadas usando o Precision 2000. In Algumas experiências, a solução de corante azul no diluente de tampão TRIS foi distribuída em placas limpas e secas (96 poços ou 384 poços) e adicionou-se um diluente tampão TRIS incolor. A absorvência resultante foi então lida a 595 nm utilizando um leitor de absorvência de microplacas. Em outras experiências, adicionou-se corante amarelo aos poços que já contêm o diluente. Nestas experiências, tanto o corante quanto o tampão incolor também continham 0,1 tensioactivo Tween 20. Após a adição das soluções aquosas, a absorvância de cada poço da placa foi determinada a 450 nm usando um leitor de absorvente PowerWave X (BioTek Instruments, Inc. Winooski, VT). Os dados de ambas as experiências foram então exportados para o Microsoftreg Excel e a redução de dados foi realizada. A precisão foi determinada usando um método gravimétrico ou a diluição do corante. As determinações utilizando o método gravimétrico foram realizadas por placas de pesagem pré-preenchidas com 100 μl de PBS usando um balanço analítico. Depois de dispensar o fluido apropriado à placa usando o Precision 2000, a placa foi rapidamente pesada novamente. As mudanças de peso resultantes, quando divididas pelo número de poços de placa, retornaram um volume médio por bomitão. Ao calcular a precisão da dispensa usando o método do corante, o tinte amarelo concentrado foi pipetado em placas pré-cheias com a Precision 2000. Após a mistura em um agitador orbital durante 60 segundos, a absorvância foi lida em um espectrofotômetro de microplaca PowerWave X (BioTek Instruments, Inc.). Os valores de absorvência resultantes foram comparados com uma curva de calibração pré-existente e o volume de distribuição interpolado. O sistema de pipetagem automatizado Precision 2000 realiza muitas das tarefas de pipetagem de rotina associadas à preparação da amostra para manchas de microarrays. O Precision 2000 pode ser instalado em qualquer superfície de laboratório estável, incluindo bancos de laboratório padrão, bem como carros móveis. A pequena pegada até permite o uso dentro de um gabinete de biossegurança. O Precision 2000 pode ser programado usando o software Precision Powerauml rodando em um PC conectado. Após a conclusão da programação, os arquivos necessários são baixados para o instrumento e o Precision 2000 é capaz de funcionar autônomo. Esses recursos oferecem as seguintes vantagens: o sistema pode ser movido de forma rápida e fácil para diferentes locais e manter uma operação confiável. O usuário final pode reprogramar o sistema conforme desejado sem necessidade de reinstalação ou programação de fábrica. Embora existam inúmeras tarefas que podem ser realizadas pela Precision 2000, aqui estão as descrições de algumas das tarefas realizadas pela Precision 2000. Observe que o texto aceso indica tarefas no processo não executadas pela Figura de Configuração de Reação de PCR Precision 2000. 2: Layout da plataforma de precisão 2000 para cultura de levedura Configuração de PCR. A Precision 2000 transfere 80 microlhas de mistura principal de PCR contendo enzimas polimerase, primers e desoxinucleótidos para todos os poços de uma placa de PCR de 96 poços (sombreado de laranja) da calha de reagente (sombreado amarelo) usando pontas de pipeta padrão (sombreado verde). Usando dicas de barreira de aerossol (sombreamento azul), a Precision 2000 transfere 20 microl de cultura de fermento em placas de poço profundo para a placa de PCR de 96 poços (sombreado de laranja). As placas de PCR são transferidas manualmente para um termociclador MJ Research onde é realizada a execução de termocliação específica de iniciador. As reações de PCR concluídas são então transferidas para um Qiagen 3000 BioRobot para limpeza de produtos de PCR. Após a remoção de iniciadores e nucleotídeos, as reações de PCR são liofilizadas a secura com um liofilizador Savant. Após a liofilização, as amostras são ressuspensas em 20-25 microl de água destilada usando o Precision 2000. Para um armazenamento mais compacto, as amostras de quatro placas de 96 poços são transferidas para uma microplaca de 384 poços e armazenadas em ndash20ordmC até ndash80ordmC até serem necessárias. Imediatamente antes da mancha, as amostras são então descongeladas e um volume igual de tampão de mancha 2X (contendo sais e DMSO) é adicionado usando o Precision 2000. As amostras são manchadas usando um robô de manchas Microarray BioRobotics. Preparação de amostra de PCR Check-Gel Figura 3: Layout de plataforma de precisão 2000 para preparação de amostras de gel. Usando dicas de aerossol (sombreamento azul), a Precision 2000 transfere 4 mul amostras dos poços da placa de coleta Qiagen para os poços correspondentes de uma placa de fundo redondo. Usando dicas normais (sombreado verde), 5 μl de tampão de carga de gel são adicionados às amostras na placa de fundo redondo e misturados usando o Precision 2000. Figura 4: Feche a imagem do braço da pipeta com as pontas. As amostras estão sendo transferidas de um poço de 96 po para uma microplaca de 384 poços. Resultados da pipetagem de baixo volume de precisão 2000 Conforme demonstrado na Figura 5, quando as soluções aquosas foram distribuídas em placas secas, observaram-se grandes diferenças de poço a poço com volumes muito pequenos (menos de 3 mul). O Coeficiente de Variância (CV) para uma placa com uma dispensação de 1 mul foi tão grande como 60. No entanto, as diferenças de bom-a-bem diminuem rapidamente com o aumento do volume de distribuição. Os volumes de distribuição tão pequenos quanto 3 mul têm um CV inferior a 4. Quando pequenos volumes de líquido são distribuídos em placas de 384 poços, observa-se um padrão semelhante de variação de poço para o bem (Figura 6). Ao distribuir em placas secas de 384 poços, observam-se diferenças muito grandes entre os poços em 1-2 m. No entanto, o volume de distribuição superior a 3 mul demonstra excelentes resultados. Quando pequenos volumes aquosos são distribuídos em poços de placas parcialmente cheios, observa-se uma marcada melhora na precisão (Figura 7.) Volumes tão pequenos quanto 1 mul podem ser dispensados com um coeficiente de variância inferior a 4. Com volumes de distribuição de 3 mul Bem ou maior, o CV é rotineiramente inferior a 2. O padrão de precisão aumentada com volumes de distribuição de 3 μm ou mais é de natureza semelhante ao observado na distribuição em poços secos. No entanto, o grau de melhoria é diminuído como resultado dos resultados amplamente melhorados em 1-2 volumes de distribuição (2-3.5 vs. 30-60 CVs). Conforme demonstrado na Figura 8, a opção Precision 2000rsquos Rapid Dispense Mode também permite a entrega precisa de fluidos. Usando uma placa de 96 ou 384 poços, volumes tão pequenos quanto 10 mil podem ser dispensados do colector de distribuição de reagente em massa. Ao distribuir 10 mil em uma placa bem, parece que a placa de 384 poços oferece uma melhor precisão. No entanto, em volumes de 20 μl ou mais, parece haver pouca diferença entre as diferentes matrizes de placas (Figura 8). Figura 5: Dispense precisão em placas de 96 poços secas usando a pipeta Precision 2000 em vários volumes de distribuição. O volume indicado de tampão TRIS contendo coloração alimentar azul foi distribuído a todos os poços de uma placa de 96 poços usando a pipeta. Após a distribuição do corante colorido, 100 mg de tampão TRIS foram distribuídos em cada poço usando o colector de distribuição a uma velocidade de 5. A absorvância a 595 nm para cada poço de cada placa foi determinada usando um leitor de absorvente de microplacas. Observe que cada barra de dados representa o CV de uma placa inteira. Figura 6: Precise a distribuição em placas de 384 poços secas usando a pipeta Precision 2000 em vários volumes de distribuição. O volume indicado de tampão TRIS contendo coloração alimentar azul foi dispensado para todos os poços de uma placa de 384 poços usando a pipeta. Após a distribuição do corante colorido, 50 mg de tampão TRIS foram distribuídos em cada poço usando o colector de distribuição a uma velocidade de 5. A absorvância a 595 nm para cada poço de cada placa foi determinada usando um leitor de absorvente de microplacas. Observe que cada barra de dados representa o CV de uma placa inteira. Figura 7: Precisão de distribuição em placas de 96 poços parcialmente cheias usando a pipeta Precision 2000 em vários volumes de distribuição. Em cada poço de uma placa, distribuíram-se 100 μl de solução de verificação de QC 3 usando a pipeta como diluente. Em seguida, o volume indicado de corante amarelo foi distribuído para todos os poços de uma placa de 96 poços usando a pipeta. A absorvância a 450 nm para cada poço de cada placa foi determinada usando um Espectrofotômetro de Microplaca PowerWaveX (BioTek Instruments, Winooski, VT). Observe que cada barra de dados representa o CV de uma placa inteira. Figura 8: Precisão de distribuição em placas secas de 96 ou 384 poços usando o colector Precision 2000 em vários volumes de distribuição. O volume indicado de tampão TRIS contendo corantes azuis foi distribuído a todos os poços de uma placa de 96 ou de 384 cavidades usando o colector. Depois de distribuir o corante colorido, a garrafa do buffer foi alterada para o tampão TRIS apenas e foram distribuídos 100 mil ou 50 milhas de tampão TRIS em cada poço das placas de 96 ou 384 poços, utilizando o colector a uma velocidade de 5. A absorvância a 595 nm para cada poço de cada placa foi determinada utilizando um leitor de absorvência de microplacas. Observe que cada barra de dados representa o CV de uma placa inteira. Discussão Estes dados indicam que o Precision 2000 pode ser usado para distribuir os pequenos volumes aquosos necessários para a preparação da amostra de microarray com precisão e precisão. O uso do braço da pipeta permite flexibilidade infinita em relação às transferências de fluidos. O coletor usado na opção Precision 2000rsquos Rapid Dispense Mode também é bastante útil para distribuições de baixo volume. Este colector de distribuição de reagente em massa tem a vantagem de ser muito rápido e é bastante útil quando se dispensa até 10 microl por poço. Vários fatores influenciam a capacidade de distribuir pequenos volumes com a Precision 2000. As seringas de deslocamento positivo dependem do deslocamento do ar para empurrar o fluido para fora do cano da ponta. Infelizmente, os materiais gasosos, ao contrário dos líquidos, são propensos a compressão, o que sugere que a precisão ocorre em grandes volumes (por exemplo, 100 microl), onde a maioria da coluna é líquida. Isso muitas vezes impede a capacidade de ser preciso em volumes claramente menores. Como o ar também é propenso a expansão e contração como resultado de mudanças de temperatura, ter amostras e reagentes equilibrados para a temperatura ambiente também resultará em dispensação mais precisa e precisa. Para as distribuições mais precisas e precisas, é aconselhável incluir um pré-captação inicial de um pequeno volume. Isso proporcionará alguma compensação pela compressão de gás aereo, além de fornecer um ambiente úmido dentro da ponta da pipeta. Dispensar em um líquido geralmente é mais preciso e preciso do que dispensar em um poço vazio. Este fenômeno é provavelmente devido a uma pequena quantidade de fluidos que absorvem a parte externa da ponta da pipeta e não são distribuídos no poço. Ao se distribuir em um líquido pré-existente, é mais provável que o fluido se disperse no fluido do que na ponta como resultado da tensão superficial. O sistema de pipetagem com microplacas automatizadas Precision 2000 é um sistema de manuseio de líquidos preciso e preciso, capaz de automatizar a maioria das aplicações de pipetagem, dispensação e diluição de rotina. Ideal para um sistema automatizado flexível e versátil com sua pequena pegada, provou ser muito capaz de pipetar de baixo volume (1 microl) para acomodar volumes de ensaio baixos de hoje. A flexibilidade e a mobilidade deste sistema também permitem que muitas das tarefas de pipetagem manual necessárias para a detecção de microarrays sejam automatizadas. Referências Held, P. and Cohen, D. (2000) Usando o BioTekrsquos Precision 2000 para distribuir pequenos volumes. Nota de Aplicação, BioTek Instruments Inc. Highland Park, Box 998 Winooski, VT 05404, biotecnologia TradeMarks e Copyrights Precision 2000, Precision Power, PowerWave são marcas registradas para BioTek Instruments, Winooski, VT. O Microsoftreg Excel e o ActiveXreg são protegidos por direitos autorais pela Microsoft Corporation, Redman, WA.
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